凍干保護劑是除賦形劑外，給于藥物有效成分在凍干機冷凍干燥過程及凍干后儲存階段保護藥物藥效的成分。常用保護劑有糖類、白蛋白、聚乙二醇等等。凍干保護劑可影響生物制品的質(zhì)量、效價和穩(wěn)定性，改變生物制品的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品干燥能力并增大產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性。耐熱凍干保護劑有免疫活性但無藥理活性，可在凍干和保存時維持疫苗的穩(wěn)定性，初次干燥時在適宜的溫度下疫苗不倒塌，企業(yè)低成本即可獲取。
　　
　　一、分類
　　
　　(一)按相對分子量分按相對分子量分可分為低分子化合物和高分子化合物。
　　
　　1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水分緩解作用。如：酸性物質(zhì)：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；中性物質(zhì)：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇；堿性物質(zhì)：精氨酸、組氨酸。
　　
　　2.高分子化合物高分子化合物對微生物有保護作用，可促進其升華形成耐熱骨架阻斷熱傳導和熱輻射。如：白蛋白、明膠、蛋白胨、脫脂奶粉。水解明膠水解明膠可去掉雜質(zhì)蛋白、無抗原性、無過敏反應(yīng)、無熱源，并且分子量小、均質(zhì)、易溶于水，可過濾除菌，共熔點為-12℃。對微生物的保護作用高出普通明膠10％以上。脫脂奶粉可促進升華、加熱滅菌，易取得均質(zhì)產(chǎn)品，并擴大細胞相互間的距離。
　　
　　(二)按功能和性質(zhì)分1.耐熱凍干保護劑耐熱凍干保護劑在凍結(jié)和干燥過程中，可防止活性組分變性，如海藻糖、蔗糖、聚維酮（PVP）等。2.填充劑可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，如：甘露醇、明膠等。3.抗氧化劑產(chǎn)品的自身氧化可消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧；放入電子或氫離子，可阻斷凍干樣品中氧化鏈式反應(yīng)，抑制氧化酶活性，防止樣品在冷凍干燥及儲藏過程中氧化變質(zhì)。如硫代硫酸鈉、維生素E、維生素C等。4.酸堿調(diào)整劑在冷凍干燥、儲藏過程中，將生物制品PH值調(diào)整到活性物質(zhì)zui穩(wěn)定區(qū)域。常用的有：磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉。
　　
　　(三)按物質(zhì)的種類分
　　
　　1.糖/多元醇類單糖（葡萄糖、半乳糖）：糖與生物制品活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，起保護作用；低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低溫保護功能和脫水保護作用；海藻糖則具有相對較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。海藻糖—蛋白質(zhì)—水微冰晶的形成，有效防止了水對玻璃化態(tài)的增塑作用。并且其內(nèi)部氫鍵較少，有利于蛋白質(zhì)分子間形成氫鍵。多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）:多元醇具有和糖一樣的作用。甘露醇無菌濾液穩(wěn)定，不易被氧化，可提供支持結(jié)構(gòu)，并且不與活性組分發(fā)生反應(yīng)；山梨醇是甘露醇的同分異構(gòu)體，但其溶解度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠的透明狀液體，有旋光性，略有甜味，具有吸濕性，高溫下不穩(wěn)定，在冷凍干燥配方中，山梨醇常用作填充劑。
　　
　　2.表面活性劑類表面活性劑是降低界面的張力，親水、親油基組成的化合物。表面活性劑可分為離子型、非離子型。凡是溶于水能電離成離子的，稱為離子型表面活性劑，否則稱為非離子型表面活性劑。表面活性劑在凍結(jié)和脫水過程中既能降低冰、水界面張力所引起的凍結(jié)和脫水變形，又能在復水過程中對活性組分起到潤濕劑作用。但在凍干生物制品測定和長期儲藏中，表面活性劑并沒有保護作用。
　　
　　3.氨基酸類氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，其中zui主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸類保護劑有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和組氨酸，試驗表明氨基酸是的填充劑。低濃度甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致PH值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性，并且能升高成品的塌陷（崩解）溫度，阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。
　　
　　4.其它添加劑類其它添加劑類保護劑包括抗氧化劑、緩沖劑和凍干加速劑。抗氧化劑：一種是抗氧化劑的自身氧化，消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧，使凍干樣品物料不被氧化；另一種使抗氧化劑給出電子或氫離子，阻斷凍干樣品中的氧化鏈式反應(yīng)；還有一種方式是抗氧化劑通過抑制氧化的活性而防止凍干樣品的氧化變質(zhì)，如維生素E、維生素C、硫代硫酸鈉、硫脲。緩沖劑：蛋白質(zhì)具有兩性電解質(zhì)，既能和酸作用又能和堿作用。在中性環(huán)境中，大多數(shù)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，由于蛋白質(zhì)溶液在凍結(jié)過程中溶液的濃度是逐漸升高的，所以在高濃度時可改變?nèi)芤旱腜H值，PH值變化4個單位導致蛋白質(zhì)變性，使生物制品失活。因此在凍干保護劑配方中，需添加適量緩沖劑。如，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉。凍干加速劑：冷凍干燥過程耗時長、耗能多，迫切需要對凍干循環(huán)進行優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本。叔丁醇是一種小分子醇，與水*互溶，具有低毒性、高蒸汽壓。在藥品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：可降低干燥層阻力，從而加速干燥過程，縮短干燥時間；對于難溶于水的藥品，可使產(chǎn)品具有較高的比表面積、好的外觀，并易于復水，提高藥品溶液和凍干品的穩(wěn)定性，且有一定的抑菌作用。
　　
　　二、凍干保護劑的作用機理
　　
　　(一)凍結(jié)過程中低溫保護機理“優(yōu)先作用”機理認為，蛋白質(zhì)溶液在達到zui大凍結(jié)濃度之前，優(yōu)先與水作用（優(yōu)先水合），而保護劑優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（優(yōu)先排斥）。這是由于保護劑的加入，增大了水分子的表面張力，促使了蛋白質(zhì)分子優(yōu)先與水分子相互作用。在這種情況下，蛋白質(zhì)分子外表面比其體相中有相對較多的水分子和相對較少的保護劑分子，從而也就保護了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。“優(yōu)先作用”機理并不能*解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時保護蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。因此，必然存在其他保護作用機理。表面張力減小的機理可以用于解釋表面活性劑對蛋白質(zhì)溶液凍結(jié)過程的保護。限制蛋白質(zhì)分子擴散的機理認為，許多保護劑都能夠提高溶液的粘度，抑制活性分子的擴散。
　　
　　(二)干燥過程中的保護機理玻璃態(tài)假說在含有保護劑溶液的干燥過程中，當濃度足夠大且保護劑不發(fā)生結(jié)晶時，保護劑與活性組分混合物就會形成玻璃態(tài)。玻璃態(tài)分為兩種即：強玻璃和弱玻璃。在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下進行降溫，弱玻璃粘度的增加，比強玻璃來的快。因此，賦形劑形成弱玻璃要比形成強玻璃的保護效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因為能夠形成一種弱玻璃而具有很好的保護作用。水替代假說由于蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接。當?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過程中推動水分后，保護劑的羥基能夠替代蛋白質(zhì)表面上水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層“水合層”，這樣就可以保護氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，從而保持了蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和功能的完整性。當冷凍干燥時，保護劑可與生物大分子的失水部位形成氫鍵，替代保持生物大分子凍干損傷。
　　
　　(三)儲藏過程中的保護機理干燥過程中出現(xiàn)的引起蛋白質(zhì)變質(zhì)的時間尺度為小時，而對于儲藏而言，時間尺度為月或年。在正確的冷凍干燥工藝中，要求產(chǎn)品溫度接近于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而在正確的儲藏條件下，環(huán)境溫度應(yīng)當比其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低得多，以獲得很長的松馳時間。
　　
　　三、耐熱凍干保護劑配方需要注意的問題
　　
　　確定*的pH值生物制品中的活性成分（如蛋白質(zhì)）只有在很小的PH值范圍內(nèi)才是穩(wěn)定的，并且不同的PH環(huán)境會影響蛋白質(zhì)的溶解性。*的PH環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和它在溶液中的溶解性，冷凍干燥配方的PH對凍干生物制品長期儲藏的穩(wěn)定性也會帶來很大影響。另外，酸堿度會影響固體狀態(tài)下蛋白質(zhì)的物理和化學的穩(wěn)定性。緩沖劑的選擇許多緩沖劑能夠用于生物制品耐熱保護劑配方中，但是并非每一種緩沖劑都能夠用于任何溶液；對PH值敏感的蛋白質(zhì)溶液，就應(yīng)當避免使用磷酸鈉緩沖液，這是由于在凍結(jié)過程中，Na2HPO4易于優(yōu)先結(jié)晶，使得溶液的PH降低，zui終引起蛋白質(zhì)變性；正確選擇緩沖劑的濃度也是很重要的。填充劑的選擇填充劑有相當好的溶解性，與生物制品中活性組分相容，沒有或者只有很小的毒性，具有較高的共晶溫度。低溫、干燥保護劑的選擇糖類是生物制品冷凍干燥過程中使用zui頻繁的保護劑，一般不選用還原性糖，因為它可能與蛋白質(zhì)之間發(fā)生非酶褐變反應(yīng)；某些鹽類也要用作生物制品在冷凍干燥過程中的保護劑；某些聚合物，因其能提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而常被用作保護劑。但是，聚合物與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵的能力遠遠低于糖類，所以常常采用聚合物和糖聯(lián)合使用，當然，這種方式并不是對每一種蛋白質(zhì)都是有效的。本研究采用上海億倍中試機型YB-FD-50L進行凍干保護劑效果驗證。上海億倍YB-FD-50L機型可實現(xiàn)預凍多階段控制，預凍溫度可調(diào)可控；升華階段及解析階段可按工藝要求進行制品溫度，箱內(nèi)真空度及升溫速率控制。驗證過程中證實預凍過程中凍干保護劑達到需求效果關(guān)聯(lián)因素有：凍干設(shè)備性能（凍干機隔板均一性，降溫速率大小及傳熱性能等）；凍干工藝是否擬合凍干保護劑性能；凍干保護劑濃度是否正確。